抗核抗体HEp－2细胞间接免疫荧光模型及其结果报告方式国际共识解读

胡朝军 周仁芳 张蜀澜 秦晓松 武永康 牛家峰 杨再兴 何敏 王春燕 罗静 黄清水 李晞 张铁汉 李永哲 选自中华检验医学杂志, 2016,39(11)

抗核抗体(antinuclear antibodies，ANA)是自身免疫病(autoimmune diseases，AID)重要的血清自身抗体，ANA的检测结果对AID的诊疗及病情评估具有重要作用。ANA是以真核细胞各种成分为靶抗原的非器官特异性自身抗体。自1957年采用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence，IIF)法检测ANA以来^[1]，ANA的概念已经使用50余年。随着免疫荧光抗体技术的改进及人源培养细胞抗原基质的广泛应用，目前对ANA靶抗原的理解已由传统的细胞核成分扩展到包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等^[2,3]的整个细胞。ANA常用的检测方法包括使用纯化或重组抗原建立的ANA筛查方法，如ELISA和以HEp－2细胞为基质的IIF法等。前者具有操作简单、可实现自动化等优点，但是使用纯化或重组抗原检测ANA总抗体，存在纯化抗原过程中的抗原性"减弱"或"失活"，或重组抗原的决定簇缺乏部分天然的高级结构及无法完全重组全部抗原成分而导致假阴性等缺点。后者由于HEp－2细胞具有人源性、核抗原种类丰富、特异性强、含量高、核大、细胞结构清晰、易于结果观察及荧光染色模型分析，以及可以检测ANA总抗体，因此以HEp－2细胞为基质的IIF法仍然被美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)、欧洲自身免疫标准化促进会(European Autoimmunity Standardization Initiative，EASI)等专业学会推荐为ANA检测的"参考方法"。

一、抗核抗体HEp－2细胞间接免疫荧光模型命名

国内关于ANA HEp－2细胞间接免疫荧光模型介绍的专业图谱书籍较少，目前广泛使用的两本图谱分别为2000年马东来主编的《自身抗体及免疫荧光模式》^[4]和2014年李永哲主编的《自身抗体免疫荧光图谱》^[5]。ANA HEp－2细胞间接免疫荧光模型复杂，各国学者多年来不断致力于规范各种荧光模型名称。2014年8月28日在巴西圣保罗举行的第12届国际自身抗体和自身免疫研讨会上，由来自15个国家的研究机构、临床医生和诊断实验室的66位专家经过为期1 d的研讨，形成ANA HEp－2细胞间接免疫荧光染色模型命名标准化国际共识^[6]。该国际共识中将ANA HEp－2细胞间接免疫荧光染色模型分为3类：细胞核荧光模型、细胞浆荧光模型和细胞有丝分裂荧光模型，同时定义了每种荧光模型，并对鉴定要点进行了详细描述。ANA HEp－2细胞间接免疫荧光染色模型命名：所有HEp－2细胞间接免疫荧光染色模型都赋予一个唯一AC(anti－cell)开头的编码，并登记于ANA荧光模型国际共识(international consensus on antinuclear antibody pattern，ICAP)网站(www.ANApatterns.org)，见图1。ANA HEp－2细胞间接免疫荧光染色模型结果回报：虽然目前绝大多数的ANA IIF检测试剂都采用HEp－2细胞作为检测基质，但是个别ANA HEp－2细胞间接免疫荧光染色模型在不同厂家检测试剂上呈现的荧光模型仍有差别，如棒环状荧光模型(rods and rings，RR)，见图2。鉴于此，并基于2014年的ANA HEp－2细胞检测巴西指南^[7]，该指南为确保具有重要临床意义的荧光模型被准确识别，根据荧光模型鉴别难易程度不同，将ANA荧光模型分为必报荧光模型(基础水平报告荧光模型)和选报荧光模型(专家级水平报告荧光模型)。该共识明确指出目前设置的2大类荧光模型报告等级是暂时的，并且建议具有相应能力的自身抗体检测实验室人员尽量报告专家级水平荧光模型。

图1

抗核抗体HEp－2细胞间接免疫荧光染色模型分类及命名^[6]

二、细胞核荧光模型

细胞核荧光模型是指HEp－2细胞在分裂间期细胞核荧光染色所显现的荧光形态，共包括7种主要核型和12种亚核型，见图1。临床诊疗日常工作中，必报荧光核型包括：均质型(AC－1)、斑点型(AC－2，4，5)、致密斑点型(AC－2)、着丝点型(AC－3)、核点型(AC－6，7)和核仁型(AC8，9，10)；专家级选报荧光模型包括：核膜型(AC－11，12)、抗增殖细胞核抗原型(PCNA型AC－13)及着丝点－F型(AC－14)。

1．均质型：

分裂间期HEp－2细胞核浆呈均匀荧光染色，通常细胞核仁区荧光染色强度与细胞核浆其他区域一致，或者细胞核仁区无荧光染色。当标本中抗体浓度过高时，部分标本可见分裂间期HEp－2细胞核膜内缘荧光染色加强，产生周边型荧光染色。分裂期HEp－2细胞的浓缩染色体呈均匀着染，染色体区外周细胞核浆荧光染色阴性。分裂间期或者分裂期HEp－2细胞浆无荧光染色。均质型对应的靶抗原主要为染色体成分，如抗双链DNA(double stranded DNA, ds－DNA)抗体、组蛋白、核小体等，与致密斑点型的临床意义完全不同，为了避免误导临床医生，在临床诊疗工作中鉴别两种荧光模型分别报告非常重要。

2．斑点型：

分裂间期HEp－2细胞核浆呈细颗粒、粗颗粒或大颗粒型荧光染色，核仁区阴性或者部分荧光着染[例如存在抗干燥综合征抗原B (Sjogren's syndrome antigen B, SS－B)抗体或抗Ku抗体时]；分裂期HEp－2细胞的浓缩染色体无荧光染色，染色体区外可显示颗粒型荧光染色。致密斑点型分裂间期HEp－2细胞核浆呈现细颗粒型致密的荧光染色，分裂期HEp－2细胞浓缩的染色体区为强的颗粒状荧光染色，染色体区域外为阴性。此荧光核型见于抗致密细颗粒－70抗体，其靶抗原为晶状体上皮细胞衍生生长因子和(或)DNA结合转录共激活因子p75，该抗体可见于各种AID、慢性感染性疾病、慢性疲劳综合征及健康人群。

3．着丝点型：

分裂间期HEp－2细胞核浆呈现大小一致、明亮的点状荧光均匀散布于细胞核，数量一般为40～60个，核仁常无荧光染色，有时也可见点状荧光聚集于核仁区域。分裂期HEp－2细胞点状或颗粒状荧光集中于浓缩的染色体区，呈现"棒状"或"带状"荧光染色。此荧光模型的靶抗原主要针对着丝粒染色体相关蛋白。

4．核多点型：

分裂间期HEp－2细胞核浆常呈现6～20个(平均10个)分散大小不一的点状荧光染色，核仁不染色。分裂期HEp－2细胞浓缩的染色体区阴性，但在染色体以外的范围有时可见散在的颗粒荧光。其相关靶抗原包括PML、Sp100及MJ/NXP－2。

5．核少点型：

分裂间期HEp－2细胞核浆常呈现1～6个点状荧光染色，常靠近核仁区。分裂期HEp－2细胞浓缩的染色体区阴性。其相关靶抗原包括p80－螺旋蛋白和运动神经元生存蛋白。

6．细胞核核仁型：

主要指分裂间期HEp－2细胞的核仁荧光染色模型，该类荧光模型也属必报荧光模型。在有经验的自身抗体检测实验室，核仁型可进一步报告为核仁均质型、核仁斑片型和核仁颗粒型。核仁均质型为分裂间期HEp－2细胞整个核仁呈现均匀荧光染色，核浆可有相对较弱的弥漫性荧光染色；分裂期HEp－2细胞浓缩的染色体区阴性，在染色体区外围可呈现弥漫性荧光染色。核仁斑片型，分裂间期HEp－2细胞核仁呈现明亮大颗粒荧光染色，常融合成片状，细胞核浆无荧光染色；分裂期HEp－2细胞浓缩的染色体阴性，染色体外围呈不规则环状荧光染色。核仁颗粒型，分裂间期HEp－2细胞核仁呈现点状荧光染色，核浆无荧光染色；分裂期HEp－2细胞浓缩的染色体区阴性，核仁形成区可见明亮的点状荧光，胞浆可呈现弱的弥漫性荧光染色。

7．细胞核膜型：

分裂间期HEp－2细胞的核膜呈现光滑核膜型或点状核膜型，而分裂中期赤道板无荧光，不同的荧光模型针对不同的特异性自身抗体及具有不同的临床意义。

8．多形性荧光模型：

主要包括抗增殖细胞核抗原型(proliferating cell nuclear antigen，PCNA型)和着丝点－F型。PCNA荧光模型的特点是在HEp－2细胞核浆中见大小不一的斑点型荧光，在S期HEp－2细胞核浆中见荧光强度和颗粒最大的荧光染色，在S期的后期和G2期的早期，荧光斑点逐渐稀疏，核仁可呈荧光染色。G1期细胞和中期细胞通常不染色。着丝点－F型，分裂间期HEp－2细胞核浆中呈现细颗粒状荧光染色，核仁无荧光染色。G2期为强的荧光染色，而G1期无荧光染色或弱的荧光强度。着丝粒染色仅出现在前中期和中期HEp－2细胞，呈现多个对齐的小、弱的点状荧光。前中期细胞的细胞核膜常呈现较弱的荧光染色。分裂期HEp－2细胞浆周围为典型的弥漫性荧光染色。而部分着丝点F型也可见中间体荧光染色。

三、细胞浆荧光模型

细胞浆荧光模型主要包括5大类：胞浆纤维型、胞浆颗粒型、线粒体型、高尔基体型和棒环状荧光模型。这5大类核型被认为是临床诊疗日常工作中必须报告的荧光模型，每大类所包含的具体荧光模型可由有经验的自身抗体检测实验室选择报告。

1．胞浆纤维型：

包括线状、丝状及片段状荧光模型。胞浆线状纤维型荧光模型的特征是HEp－2细胞骨架纤维，部分有小的、不连续的颗粒状沉淀的荧光染色，其主要的靶抗原为位于细胞长轴方向的横纹肌肌动蛋白。胞浆丝状纤维型荧光模型为核膜扩散出的细丝和纤维，通常集中于细胞核周边并扩展到细胞浆，其主要的靶抗原为波形蛋白和细胞角蛋白。片段状胞浆纤维型荧光模型为沿应力纤维呈小片段、规律分布的致密性荧光增强小体，其主要的靶抗原包括α－辅肌动蛋白、纽蛋白和原肌球蛋白。

2．胞浆颗粒型：

包括胞浆散点型、胞浆致密颗粒型和胞浆细颗粒型。胞浆散点型为分裂间期HEp－2细胞浆呈现大小不等、数量及分布不均的明显颗粒状荧光染色，靶抗原包括甘氨酸/色氨酸(glycine－and tryptophan，GW)体、溶酶体、早期内涵体抗原1及胞浆联接蛋白等。胞浆致密颗粒型为分裂间期HEp－2细胞浆呈现接近均质型的致密细颗粒型荧光染色，靶抗原包括苏氨酰－tRNA合成酶、丙氨酰－tRNA合成酶和核糖体P蛋白等。胞浆细颗粒型为分裂间期HEp－2细胞浆呈现细颗粒型荧光染色，靶抗原包括组氨酰转移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)合成酶等。

3．线粒体型：

分裂间期HEp－2细胞浆呈现从细胞核边缘延伸至整个细胞浆的不规则粗颗粒网状荧光，细胞核和核仁阴性。强阳性时可导致细胞核呈颗粒状荧光染色。分裂期HEp－2细胞浓缩的染色体区阴性，染色体周围呈致密的粗颗粒样荧光染色。

4．高尔基体型：

分裂间期HEp－2细胞浆毗邻细胞核的一端或者围绕核周呈现大小不均的颗粒型荧光染色。靶抗原高尔基－95/GW130、高尔基－97、高尔基－160和高尔基－245等。

5．棒环状荧光模型：

分裂间期HEp－2细胞浆毗邻细胞核的一端呈现圆环状(直径2～5 mm)或者棒状(长度3～10 mm)荧光染色，其主要的靶抗原为次黄嘌呤5'磷酸盐脱氢酶2。

四、细胞有丝分裂期荧光模型

细胞有丝分裂期荧光模型指与细胞有丝分裂密切相关的荧光染色模型。主要包括中心体型、纺锤体纤维型、分离带型和染色体型。

1．中心体型：

分裂中期HEp－2细胞染色体区两极(纺缍体顶部位置)呈现明亮的圆点状荧光染色，有丝分裂后期两个荧光亮点位于细胞的两端，分裂间期HEp－2细胞浆常呈现单个圆点状荧光染色，荧光圆点靠近核膜。其靶抗原包括多种成分，如烯醇化酶、中心粒周围蛋白、中心体相关蛋白(centrosome－associated protein，Cep)250、Cep110等。

2．纺锤体纤维型：

分裂期HEp－2细胞纺锤体两极间呈现纤维丝状荧光染色，特别是中期细胞呈现明亮、完整的纺锤体纤维丝状荧光，分裂末期细胞间桥的边缘有荧光染色，部分中间体区域可见荧光，分裂间期细胞常无荧光染色。靶抗原包括相对分子质量130 000驱动蛋白相关蛋白，参与有丝分裂微管组装的驱动蛋白样蛋白。细胞核有丝分裂复合物荧光模型是纺锤体纤维型的一种亚型。在分裂间期HEp－2细胞核浆呈现明亮的致密细颗粒斑点型，核仁无荧光染色；分裂中期和后期在纺锤体两极及纺锤体纤维的近端部分呈现出强的荧光染色，也被描述为三角形或香蕉形的荧光染色；分裂末期HEp－2细胞间桥无荧光染色。靶抗原为相对分子质量210 000的亲中心体蛋白。

3．细胞桥联型：

受细胞分裂周期影响该核型荧光表现各异，核分裂末期和胞质分裂期荧光位于分裂沟、收缩环、中间体和干体区。尽管在分裂间期荧光表现各异，但在前期和中期荧光表现为，染色体区垂直于赤道板的细拉链条索状荧光，在分裂末期，通常表现为两子代细胞交界处分裂沟的两个局限性亮点。在S期和G2期可表现为散在不均的核斑点状荧光。中间体是指胞核分裂期两子代细胞分离时形成的有丝分裂区域，分裂后期中心纺锤体和分裂末期中间区域。此共识中推荐的中间体型专指细胞中间体着色，即细胞桥联中间部分着色。中间体由150多种结构蛋白和动力蛋白组成。肌动蛋白14抗体荧光模型表现为中间体和中间带特异性荧光。中间体中心可见隆起的干体。尽管靶抗原尚未完全确认，但促使着丝粒黏附于纺锤体的Aurora激酶B，可能会是其中一种抗原。其他的分子，比如着丝粒蛋白E(centromere protein E，CENP－E)、裂殖子表面抗原2(merozoite surface antigen 2，MSA－2)、驱动蛋白样蛋白14，有丝分裂驱动蛋白样蛋白1据报道也可能是中间体蛋白。

4．染色体型：

分裂前期和中期HEp－2细胞浓缩染色体呈现细颗粒状荧光染色，浓缩染色体内和分裂间期细胞核浆无荧光染色^[8]。但是，该型抗原及临床意义并未见报道。

五、抗核抗体HEp－2细胞间接免疫荧光检测结果报告

在2014年8月28日巴西圣保罗举行第一届ANA ICAP的基础上，2015年在德国德累斯顿举行了第二届ICAP大会。本次会议讨论了ANA在AID诊疗中的重要性，并形成了ANA检测结果报告共识^[9]。在第二届ICAP大会ANA结果报告共识形成过程中，充分讨论并形成了2种可供自身抗体检测实验室选择的ANA结果报告形式。2种ANA结果报告形式都认为一份完整的ANA结果报告应该包括：ANA的检测方法、定性结果、ANA核型和滴度(采用IIF)以及对临床医生的相关建议。2种ANA结果报告形式的区别在于，其中一种将HEp－2细胞胞浆荧光模型及细胞有丝分裂期荧光模型纳入ANA阳性结果，而另一种将HEp－2细胞胞浆荧光模型及细胞有丝分裂期荧光模型纳入ANA阴性结果。ANA检测结果报告共识中建议的ANA检测结果报告范例见表1。

首先，ANA的检测报告中应明确标明ANA的检测方法，如HEp－2细胞IIF法，或者其他检测方法如ELISA、荧光免疫微球等；由于不同试剂厂家提供的荧光检测试剂可能影响不同的荧光模型，有条件的实验室可以同时注明检测方法对应的试剂厂家。其次，ANA的检测报告中应明确标明ANA的定性结果(阳性或者阴性)，采用IIF法的ANA结果随后应标明荧光模型和滴度或者荧光强度(采用荧光自动判读仪器时)；采用ELISA等其他检测方法的ANA结果随后应标明检测结果的定量数值。对于采用IIF检测ANA结果如果遇到混合核型时，核型的报告优先级顺序为细胞核荧光模型、细胞浆荧光模型、细胞有丝分裂期荧光模型。相同优先级的荧光模型，按滴度高低顺序依次报告。第三，该共识推荐在ANA的检测报告中应注明相关临床建议。

六、讨论

ANA HEp－2细胞间接免疫荧光染色模型命名标准化国际共识将ANA荧光模型分为必报荧光模型(基础水平报告荧光模型)和选报荧光模型(专家级水平报告荧光模型)的逐级报告模式是比较合理和实用的。对于国内自身抗体检测实验室人员，刚开展ANA－IIF检测或者经验不足的自身抗体检测实验室，可进行较低等级的ANA荧光模型报告。对于经验丰富的自身抗体检测实验室，为了给临床医生提供更丰富的检测信息，非常有必要进行更详细的ANA荧光模型报告，而不能仅停留于如细胞核斑点型或者细胞胞浆型的核型大类报告。值得国内自身抗体检测实验室人员重视的是ANA HEp－2细胞间接免疫荧光染色模型命名标准化国际共识中将细胞核致密斑点型(dense fine speckled，DFS)作为必报荧光模型，而国内自身抗体检测实验室人员对该荧光模型认识严重不足，常将DFS作为细胞核均质型或者细胞核斑点型报告。随着对DFS的认识不断深入，DFS的临床意义与细胞核均质型或者细胞核斑点型完全不同，中高滴度的细胞核均质型或者细胞核斑点型提示自身免疫性疾病的可能性较大，而DFS并不作为自身免疫性疾病存在的标志。因此为了避免给临床医生带来误导，在临床检测工作中将该模型区别出来单独报告具有重要意义。

基于目前国际上对ANA概念理解的不同(细胞浆荧光模型，细胞有丝分裂期荧光模型是否应该作为ANA阳性结果报告)，以及现有各种AID诊疗指南中纳入的ANA结果实质范畴，ICAP大会提出了2种可供自身抗体检测实验室选择的ANA结果报告形式。一方面，我们需要认识到越来越多的学者将ANA的定义从针对细胞核成分的抗体扩展到针对整个细胞成分的抗体。而且无论是ACR还是EASI/国际免疫协会联盟(International Union of Immunological Societies，IUIS)指南都接受除IIF法以外的其他方法如ELISA作为ANA检测的备选方法，但是这些方法检测ANA时，都会包含针对细胞浆成分的抗体，如组氨酰tRNA合成酶抗原(Jo－1 antigen，Jo－1)、核糖体P蛋白等，因此基于IIF法与这些备选方法检测结果的一致性，应该将IIF法检测ANA时的细胞浆荧光模型和细胞有丝分裂期荧光模型作为ANA阳性结果报告。另一方面，由于ANA的传统定义只将ANA定义为针对细胞核成分的抗体，所以目前纳入系统性红斑狼疮^[10,11]、干燥综合征^[12]、混合型结缔组织病^[13]、系统性硬化症^[14]和自身免疫性肝炎^[15]等许多AID疾病诊断指南中的ANA不包括细胞浆荧光模型和细胞有丝分裂期荧光模型，因此基于目前的疾病诊疗指南，如果将细胞浆荧光模型和细胞有丝分裂期荧光模型纳入到ANA阳性结果，可能会影响到相关疾病诊疗指南的临床应用。如在AIH的诊断标准评分体系中，ANA阳性根据不同滴度可获得1～3分，而细胞浆荧光模型的抗线粒体抗体阳性则会减去4分，因此在此类疾病诊疗指南中，将细胞浆荧光模型和细胞有丝分裂期荧光模型作为ANA阳性结果报告势必影响到相关指南的临床应用。此外，一些全球性的室间质评系统中仍将细胞浆荧光模型和细胞有丝分裂期荧光模型作为ANA阴性结果处理，如英国国家室间质评服务(United Kingdom National External Quality Assessment Service，UK－NEQAS)。因此，基于上述存在的问题，目前的ANA结果报告国际共识推荐2种形式。如果将来ANA结果报告中细胞浆荧光模型和细胞有丝分裂期荧光模型作为ANA阳性结果报告达到国际共识，必将引起一些现有的室间质评评分系统和AID疾病的诊疗指南的修改和更新。

ANA检测结果报告共识建议ANA检测结果报告应注明相关临床建议。国内自身抗体检测工作者在临床实践工作中常疏忽了这方面。由于针对特异性靶抗原对应的自身抗体是诊断自身免疫病的重要依据，因此在荧光模型中如果高度怀疑存在针对某个疾病特异性靶抗原的自身抗体存在时，应建议临床医生进一步进行该特异性抗体的检测。ANA检测结果报告中注明重要临床建议有助于临床医生及时准确地提出下一步检测需求，有助于患者疾病的及时正确诊断和治疗。

ANA的滴度是ANA检测结果的重要组成部分，对临床疾病诊断和病情评估有重要价值。在本共识解读成文及审稿过程中也有许多专家提及ANA滴度的重要性。由于ANA检测的滴度问题非常复杂，在ANA报告国际共识中仅提及需要报告滴度，但并未对怎样报告滴度，采用何种滴度系统(传统倍比稀释系统或者10开方的稀释系统)进行详细明确阐述。在我国，ANA检测的滴度问题实际情况更为复杂：(1)采用传统倍比稀释系统试剂，倍比稀释系统报告滴度；(2)采用10开方的稀释系统试剂，倍比稀释系统报告滴度；(3)10开方的稀释系统试剂，10开方的稀释系统报告滴度。我们期待在后续的相关专家述评或者将来建立该领域国内共识的时候将ANA滴度实验的建立、质控及稀释原则等重要临床问题进行详细讨论并逐一明确。

随着对ANA临床意义的认识不断深入，越来越多的临床工作者重视ANA检测，ANA检测的方法和结果报告的形式将在国际范围内逐步规范^[16]，该举措必将进一步促进ANA检测质量的提高和充分发挥ANA在AID临床诊疗中的价值。